1、前言

細胞毒性評估材料浸提液中潛在的生物活性物質對培養的哺乳動物細胞（）毒性反應。

其原理為黃色水溶液MTT在活細胞內代謝性還原，生成不可溶的甲臜?；罴毎臄的颗c甲臜溶于醇類后用光度計測定的色度相關。

2、試驗依據標準

2.1 GB/T 16886.5 -2022 醫療器械生物學評價 第5部分：體外細胞毒性試驗；

2.2 ISO 10993-5:2009 Biological evaluation of medical devices—Part 6: Tests for in vitro cytotoxicity。

3、試驗系統

L929細胞。

4、試驗樣品制備

依據GB/T 16886.12制備浸提液。

5、試驗步驟

5.1 細胞培養準備

采用酶促消化（胰蛋白酶/EDTA）將培養細胞從培養瓶中移出，細胞懸液在200g離心3min。用培養基重懸細胞懸液，調整密度為1×105個細胞/Ml，采用多通道移液器將100μL培養基加到96孔組織培養微量滴定板的外圍孔中（=1×104個細胞/孔）。

細胞孵育24h以形成半匯合單層。培養物在含5±1%的CO2培養箱中(37℃±1℃，濕度>90%)培養（24±2）h，使細胞生長形成單層近融合的細胞層。

5.2 接觸培養

培養24h后，從板孔中吸出培養液，另加入100μL的測試樣品浸提液、對照樣品浸提液、空白對照液和陽性對照液，所有劑量需要做至少六個平行。將空白加到96孔板的左（第2列）、右（第11列）兩側。然后在(37±1)℃，含有5±1%的CO2，濕度>90%的環境下培養24h±2h。

5.3 觀察

繼續培養24h后，在相差顯微鏡下檢查每個板，判定細胞接種系統誤差和對照與試驗組細胞的生長特性。記錄試驗樣品浸提液細胞毒性作用導致的細胞形態學方面的改變，但這些記錄不用與任何細胞毒性定量測定。對照細胞的不良生長特性可表明實驗誤差，并且可能會因此放棄該試驗。

5.4 添加MTT

檢查平板板孔細胞生長情況后，小心地從板孔中吸除培養介質，在每個測試板孔中加入50μL的MTT溶液（用不含酚紅的完全MEM培養液配置成1mg/mL），在(37±1)℃條件下培養(2±0.2)h。棄去MTT溶液，每孔加入100μL異丙醇溶解甲臜，震蕩平板，然后在570nm波長下測量每孔的吸光度值（參照波長650nm）。

5.4 數據分析

活細胞數減少導致了樣品中代謝活性降低，這直接與生成的藍紫色甲臜量有關。測試樣品與空白對照（細胞直接與浸提介質接觸）比較細胞存活率的降低可用以下公式計算：

式中：OD570e---測試樣品、陽性對照、陰性對照各組測得平均吸光度值。

OD570b---空白對照組（細胞直接與浸提介質接觸）平均吸光度值。

存活率較低時，試驗樣品潛在的細胞毒性較高。如存活率下降＜空白的70%，則魚油潛在的細胞毒性。試驗樣品50%浸提液的存活率相同或較高，否則宜重復試驗。